Sinh thiết phôi trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ

Chẩn đoán di truyền trước làm tổ (PGD – Preimplantation Genetic Diagnosis) là kỹ thuật dùng để xác định các rối loạn về gen di truyền hay bất thường trong bộ nhiễm sắc thể của giao tử hay phôi ở giai đoạn trước khi phôi bám vào nội mạc tử cung để làm tổ. Được áp dụng cho những cặp vợ chồng mang bệnh có thể di truyền qua thế hệ hoặc những cặp vợ chồng sinh con trước đó có mang bệnh. Quá trình chẩn đoán di truyền trước làm tổ bao gồm hai giai đoạn chính là sinh thiết và chẩn đoán di truyền.

Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ là kỹ thuật được sử dụng trước khi cấy trứng đã được thụ tinh vào trong tử cung của người mẹ nhằm giúp xác định các khiếm khuyết di truyền trong phôi, ngăn ngừa một số bệnh hoặc rối loạn di truyền được truyền từ bố mẹ sang trẻ.

Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm bao gồm các giai đoạn:

• Kích thích buồng trứng.
• Chọc hút trứng.
• Thụ tinh trứng với tinh trùng, sau đó phôi được nuôi cấy và chuyển vào buồng tử cung người mẹ.

Quá trình sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước làm tổ có thể được thực hiện ở 3 giai đoạn khác nhau:

• Sinh thiết trước và ngay sau khi trứng thụ tinh (sinh thiết thể cực thứ nhất và thứ hai).
• Sinh thiết phôi ở giai đoạn phân cắt (ngày thứ 3 sau thụ tinh) hay sinh thiết ở giai đoạn phôi nang (ngày thứ 5 sau thụ tinh).

Mỗi giai đoạn sinh thiết đều mang ưu điểm, khuyết điểm cũng như chỉ định riêng. Quy trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngược được gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zona pellucid (màng zona pellucid là trong quá trình di chuyển, phôi được bảo vệ bằng một màng bảo vệ bên ngoài gọi là màng trong suốt), dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật ra khỏi trứng hay phôi. Sau đó trứng hay phôi sẽ tiếp tục được nuôi cấy, mẫu vật được cố định để chẩn đoán di truyền.

3.1. Chuẩn bị trước sinh thiết

Các tế bào cần được làm sạch trước khi sinh thiết nhằm tránh chẩn đoán nhầm DNA của các tế bào này. Do vậy, những bệnh nhân có chỉ định thực hiện chẩn đoán di truyền trước làm tổ cần được thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm bằng phương pháp ICSI (bơm tinh trùng vào bào tương trứng). Danh tính của trứng, phôi và mẫu vật cũng cần được xác định chính xác và kiểm tra ít nhất hai lần ở mỗi khâu trong suốt quá trình thực hiện nhằm đảm bảo kết quả chẩn đoán di truyền của mẫu vật được liên hệ chính xác đến trứng hay phôi tương ứng.

Môi trường nuôi cấy và sinh thiết cũng đóng vai trò quan trọng nhằm đảm bảo sự phát triển tiếp theo của phôi. Môi trường sinh thiết giúp quá trình thao tác dễ dàng hơn. Một trong những môi trường quan trọng đó là môi trường không có Ca2+ và Mg2+ (Ca2+ và Mg2+ free medium). Sau đó, phôi cần được nuôi cấy bằng hệ thống chuỗi môi trường tùy thuộc giai đoạn phát triển (ví dụ như hệ thống môi trường G1, G2 (Vitrolife, Sweden) và được nuôi trong tủ cấy 3 loại khí (5% O2, 6% CO2, 89 %N2) nhằm đảm bảo quá trình phát triển tối ưu của phôi.

Vai trò môi trường không có Ca2+ và Mg2+ trong sinh thiết phôi: Ca2+ và Mg2+ đóng vài trò quan trọng trong cấu tạo các liên kết ở màng ngoài các phôi bào.

3.2. Mở cửa sổ màng zona pellucida (zona pellucida opening)

Là phương pháp tạo một lỗ ở màng bao ngoài của phôi và từ vị trí ấy, kim sinh thiết được đưa vào bên trong phôi để lấy mẫu vật ra ngoài.

Có 3 phương pháp chính được dùng để mở cửa sổ màng zona: phương pháp cơ học, hóa học hay dùng tia laser. Phương pháp cơ học thường được dùng trong sinh thiết thể cực nhưng tương đối phức tạp. Hiện nay, dùng tia laser để mở cửa sổ màng zona được xem là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng nhất.

Màng zona có vai trò quan trọng trong sự phát triển của nang noãn, sự thụ tinh, chống hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng, đồng thời có vai trò như một vỏ bảo vệ phôi khi phôi di chuyển từ vị trí thụ tinh ở tai vòi vào buồng tử cung để làm tổ. Màng zona có cấu trúc là chất nền glycoprotein (glycoprotein matrix), carbonhydrate và protein chuyên biệt của màng zona với bề dày bình thường là 13-15 μm. Độ dày màng zona sẽ mỏng dần tương ứng với sự phát triển của phôi, và đến ngày 5-6 sau thụ tinh, màng zona sẽ vỡ ra để phôi thoát ra ngoài (hatching). Quá trình thoát màng chịu ảnh hưởng của 3 yếu tố chính: sự tăng trưởng của khối tế bào phôi ở giai đoạn phôi nang, sự tiết men ly giải màng zona của phôi bào và tế bào nội mạc tử cung.

3.3. Sinh thiết mẫu vật

Có hai phương pháp chính để lấy mẫu vật ra ngoài:

Phương pháp thứ nhất là tạo áp lực âm trong kim sinh thiết để hút phôi bào vào kim sinh thiết. Phôi bào có thể được hút toàn bộ hay một phần. Nếu phôi bào chỉ được hút một phần vào kim thì cần có thêm lực kéo để nhẹ nhàng vừa hút vừa kéo phôi bào ra ngoài. Cách này thường được ứng dụng nhiều nhất trên lâm sàng.

Phương pháp thứ hai, ít được sử dụng hơn, là tạo một áp lực dương từ kim sinh thiết để đẩy phôi bào ra cửa sổ màng zona. Đối với sinh thiết phôi nang, khoảng 10-30 “tế bào ngoài” của phôi được hút ra ngoài qua cửa sổ màng zona, sau đó liên kết giữa khối tế bào bên ngoài và bên trong sẽ được cắt bằng phương pháp cơ học hay bằng tia laser.

Sinh thiết và chẩn đoán di truyền phôi ở giai đoạn phôi nang được xem là kỹ thuật mang lại kết quả di truyền chính xác nhất hiện nay với ưu điểm là nhiều tế bào được sinh thiết và chẩn đoán. Đồng thời, khi áp dụng phương pháp này, do khối phôi bào vẫn được bảo tồn nên sự phát triển tiếp theo của phôi không bị ảnh hưởng. Tuy nhiên, chuyển phôi tươi không thể thực hiện trong sinh thiết phôi nang nên sau khi sinh thiết, phôi nang phải được trữ lạnh để chờ chu kỳ chuyển phôi tiếp theo. Trong khi đó, nếu sinh thiết phôi ở giai đoạn phân cắt, phôi được chẩn đoán di truyền bình thường sẽ được nuôi thêm 2 ngày để đến giai đoạn phôi nang và được chuyển phôi vào ngày 5 của quá trình thụ tinh trong ống nghiệm. Do ưu điểm nêu trên nên hiện nay, sinh thiết phôi ngày 3 được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, tỷ lệ thể khảm ở phôi nang và phôi giai đoạn phân cắt tương đối cao là một trong những bất lợi trong chẩn đoán di truyền phôi trước làm tổ.

Phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ nhằm giúp lựa chọn phôi không mang một số bất thường di truyền xác định. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền là hai quá trình quan trong trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ. Thể cực, phôi bào hay tế bào ngoài phôi có thể được sinh thiết để chẩn đoán di truyền tùy theo từng chỉ định cụ thể.